基因制备与克隆策略管理知识分析(PPT 61页)

基因制备与克隆策略管理知识分析(PPT 61页)目录：

第一节 目的基因的制备
第二节 目的基因克隆

 

基因制备与克隆策略管理知识分析(PPT 61页)简介：

没有任何一种克隆方法能够涵盖所有好处，克隆步骤：
1）克隆一个基因的方法：cDNA 合成限制性核酸内切酶消化机械剪切 Mechanical shearing
2）加到载体上：选择寄主和载体系统
平末端连接 Blunt-end ligation
使用连接头 Use of linker molecules
粘性末端连接 Ligation of cohesive termini
同聚物尾巴 Homopolymer tailing
3）Introducing the recombinant DNA into a host cell：
重组质粒转化 Transformation with recombinant plasmid DNA
重组噬菌体DNA转染 Transfection with recombinant phage DNA
DNA体外包装  Packaging DNA in vitro

★ blunt-end ligation:
S1 nuclease destroy  the protruding ends of DNA;
DNA polymerase (klenow fragment) filling the protruding ends of DNA.
Main disadvantage:
1) is an inefficient process, require high concentration DNA for ligation;
2) vector self-ligate to produce circular molecules or the insert/vector DNAs may form concatemers instead of bimolecular recombinants, use phoshpatase  (either BAP or CIP) to prevent self-ligation;
3) cloning site disappear in the recombinant DNA

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