兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文(DOC 73页)

1 绪论....1
1.1 透明质酸的理化性质....1
1.2 透明质酸的分布及生理功能....1
1.2.1 透明质酸的分布....1
1.2.2 透明质酸生理功能....2
1.3 透明酸的应用....2
1.3.1 在化妆品中的应用....2
1.3.2 在医学方面的应用....3
1.4 透明质酸生产现状....3
1.4.1 获得高产菌株....4
1.4.2 培养基及发酵条件优化....5
1.4.3 发酵液中透明质酸含量检测方法....5
1.4.4 透明质酸的提取....6
1.5 课题研究内容和目的....6
1.5.1 本课题研究内容....6
1.5.2 本课题主要目的....7
2 透明质酸产生菌的分离、筛选与初步鉴定....8
2.1 实验材料....8
2.1.1 采样....8
2.1.2 主要培养基及溶液组成....8
2.2 实验方法....9
2.2.1 透明质酸的分离纯化....9
2.2.2 菌种的筛选....10
2.2.3 菌种的初步鉴定....10
2.3 实验结果与讨论....11
2.3.1 菌种的筛选....11
2.3.2 菌种的分类鉴定....13
2.4 本章小结....13
3 透明质酸含量检测方法建立....14
3.1 实验材料....14
3.1.1 主要仪器....14
3.1.2 主要试剂....14
3.2 实验方法....15
3.2.1 透明质酸的初步纯化....15
3.2.2 CTAB比浊法....15
3.2.3 改良Bitter-Muir法....15
3.3 结果与讨论....15
3.3.1 CTAB比浊法....15
3.3.2 Bitter-Muir法....20
3.3.3 两种方法准确性比较....22
3.3.4 两种方法精确性比较....22
3.3.5 两种方法直接测定发酵液中HA含量的比较....23
3.4 本章小结....23
4 透明质酸高产菌的诱变选育....24
4.1 实验材料....24
4.1.1 菌种....24
4.1.2 主要培养基及溶液....24
4.1.3 主要仪器....25
4.2 实验方法....25
4.2.1 LiCl处理....25
4.2.2 紫外诱变....25
4.2.3 NTG诱变....25
4.2.4 微波诱变....26
4.2.5 紫外+NTG诱变....26
4.2.6 紫外+NTG+微波诱变....26
4.2.7 中间培养....26
4.2.8 稀释涂板....26
4.2.9 突变菌株筛选....27
4.3.10 分析方法....27
4.3 结果与讨论....27
4.3.1 紫外诱变最佳时间的选择....27
4.3.2 NTG诱变最佳条件....28
4.3.3 微波诱变最佳条件选择....30
4.3.4 诱变结果分析....30
4.4 本章小结....33
5 透明质酸发酵法生产工艺条件的初步研究....35
5.1 实验材料....35
5.1.1 菌种....35
5.1.2 培养基....35
5.2 实验方法....36
5.2.1 发酵条件的优化....36
5.2.2 添加剂对发酵的影响....37
5.3 结果与讨论....37
5.3.1 发酵条件优化结果....37
5.3.2 添加剂的影响....40
5.4 本章小结....42
6 透明质酸合成酶基因克隆与载体构建初步研究....43
6.1.1 菌株、质粒....43
6.1.2培养基....43
6.1.3 酶、化学试剂....44
6.1.4主要实验试剂配方....44
6.1.5 PCR扩增用引物....44
6.2 实验方法....45
6.2.1 提取兽疫链球菌总DNA....45
6.2.2 目的基因的PCR扩增....45
6.2.3 PCR扩增DNA片段的回收纯化....46
6.2.4感受态细胞的制备....46
6.2.5 质粒DNA（PET-22b）的提取与检测....47
6.2.6目的基因片段和质粒的双酶切....47
6.2.7 双酶切产物回收....47
6.2.8 双酶切后的目的基因和质粒连接....48
6.2.9 重组质粒PET-22b导入E.coli DH5а感受态细胞....48
6.2.10 重组质粒的提取....48
6.3 结果与讨论....48
6.3.1 基因组总DNA提取结果....48
6.3.2 hasA片段的PCR扩增....49
6.3.3质粒DNA（PET-22b）的提取结果....50
6.3.4 hasA基因和PET-22b双酶切电泳检测....51
6.3.5 重组质粒的表达....51
6.3.6 转化子的测序验证....52
6.4 本章小结....53
7 结论与展望....54
参 考 文 献....56
攻读硕士学位期间研究成果....60
致  谢....61
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