经典载体构建流程教材(PPT 23页)

经典载体构建流程
I载体构建流程
提取mRNA
RT
PCR得到目的基因
PCR常出现的问题
解决方法
PCR产物纯化
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
酶切常见问题
纯化酶切产物
连接
转化
菌落PCR
酶切检测阳性克隆
挑取阳性克隆去测序
由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开来的断裂基因，
若以基因组为模板PCR得到的片段克隆进载体，
不能在原核细胞剪接内含子，
也不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。
所以要克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码的mRNA为模板。
PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，
必须通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA为模板扩增目的基因。
根据不同的目的，可有三类引物选择
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